3.氧化应激参与吸入麻醉药发育期神经毒性机制的研究进展
近20年来，越来越多临床前研究以及一些回顾性临床证据表明，在发育关键时期全身麻醉药的暴露会对大脑结构和远期学习认知记忆功能产生有害的影响（称为发育期麻醉神经毒性）。从啮齿类动物到非人灵长类动物，胎儿期到出生早期暴露于吸入麻醉药后可观察到广泛的神经元损伤、持续的树突改变、永久性神经元缺失和长期认知功能障碍，这可能对每年接受手术麻醉以挽救生命或改善生活质量的数百万幼儿产生巨大的个人和社会影响，也是麻醉科医师、神经科学家及患儿家长关心的问题。尽管吸入麻醉药导致发育期神经毒性的确切机制仍不清楚，但目前的证据表明，氧化应激在其中发挥着重要作用。因此，本文就吸入麻醉药发育期神经毒性与氧化应激相关的病理机制以及干预措施进行综述。
一、氧化应激参与吸入麻醉药发育期神经毒性
由酶（如NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、非偶联一氧化氮合成酶）和其他来源（如花生四烯酸代谢酶、脂氧合酶和环氧合酶、细胞色素P450、过氧化物酶和其他血液蛋白）活化产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS），以及线粒体产生的ROS在不同生理和病理条件下的细胞信号网络中发挥着各种作用，参与包括细胞增殖、迁移、肥大、分化，细胞骨架动力学和代谢在内的过程。氧化应激常被定义为ROS和抗氧化剂之间的不平衡以及随之而来的ROS增加导致相应的病理生理后果。过量的ROS可以与脂质、蛋白质和核酸反应，从而引起DNA损伤、细胞凋亡、炎症和抗氧化反应等多种细胞死亡机制，导致广泛的组织功能障碍和损伤。
发育中的大脑由于其高耗氧量（占全身总耗氧的20%）、高多不饱和脂肪酸含量、高水平的金属离子和低抗氧化防御的特点，更易受到氧化应激损伤。此外，研究表明发育期的神经元线粒体易受麻醉药的影响。线粒体是细胞能量代谢核心，在能量产生的过程中同时产生超氧化物。临床前研究发现吸入麻醉药可通过多个生化途径诱导发育期大脑氧化应激。其中，胚胎小鼠原代皮质神经元2%异氟烷暴露6h可导致ROS生成增加、线粒体膜电位破坏和细胞死亡。研究表明铁死亡继发于谷胱甘肽依赖性抗氧化防御失败的铁依赖性ROS生成，用选择性铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）预处理后，这些作用显著减弱。另一方面，研究发现异氟烷可显著降低超氧化物歧化酶和谷胱甘肽活性，进而导致ROS蓄积。抗氧化治疗的有益作用研究也支持氧化应激在麻醉诱导的神经毒性中的作用，在动物模型中，合成ROS清除剂预处理可有效抑制麻醉诱导的ROS上调。总而言之，目前的研究结果显示，氧化应激可能在吸入麻醉药所致发育期神经毒性中发挥关键作用。
二、氧化应激参与吸入麻醉药发育期神经毒性的病理机制
ROS在吸入麻醉药发育期神经损伤中的病理机制复杂，除直接影响神经元外，还可以通过与线粒体相互作用，影响神经发生与发育以及突触的形成。此外，还有新的机制在等待探索。其主要机制综述如下：增加神经元兴奋性、减少脑源性神经营养因子、线粒体功能失调与钙超载以及影响神经发育及突触形成。
（一）增加神经元的兴奋性
研究表明，氧化代谢的多种产物可上调海马神经元的兴奋性。当神经元暴露于某些全身麻醉药（如氧化亚氮）时，氧化代谢的副产物如过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）和羟自由基（OH-）等在神经元中增多，神经元兴奋性增加。出生后第7天的大鼠幼崽暴露于异氟烷，海马中的ROS水平升高。此外，在大脑发育过程中全身麻醉药暴露可促进锥体神经元的过度兴奋，在全身麻醉药暴露后的第3周，急性分离脑片记录的动作电位放电频率持续增加。研究表明联合应用超氧化物歧化酶和过氧化氢酶模拟物EUK-134可完全逆转全身麻醉药诱导的神经元慢性过度兴奋状态，吸入麻醉药诱导的ROS产生过多，表明全身麻醉药（咪达唑仑、氧化亚氮和异氟烷联合应用）引起神经元过度兴奋的主要原因是暴露后ROS增多。
（二）影响脑源性神经营养因子
脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神经营养因子家族的一员，在胚胎发育和神经系统正常功能的发挥中起重要作用。BDNF在海马的比例相对较高，在神经可塑性中发挥核心作用。BDNF介导海马的学习和记忆过程，表现为海马依赖性认知任务训练后BDNF表达增加。海马中的BDNF易受氧化应激的影响，并被认为参与了氧化应激诱导的神经元细胞死亡。Song等指出小鼠异氟烷暴露可导致海马超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）表达下降、BDNF水平降低，而抗氧化剂绿茶多酚处理后可有效减轻SOD的下降程度并上调BDNF水平。此外，吸入七氟烷可明显抑制大鼠海马神经元BDNF并导致认知障碍，而腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）过表达BDNF可有效减轻七氟烷诱导的大鼠氧化应激和认知障碍。吸入麻醉药可能通过激活ROS、抑制BDNF，从而影响远期的认知功能。
（三）线粒体功能失调与钙超载
吸入麻醉药发育期神经毒性目前的研究重点是线粒体损伤和ROS上调的下游结果。值得注意的是，内质网钙释放过度导致胞质内及线粒体钙超载，进一步导致细胞色素c渗漏，从而引发线粒体功能障碍。Ca2+诱导的ROS的增加和ROS调节的Ca2+的上调的相互影响可能会导致前馈和自我扩增回路的形成，引起的细胞损伤远远超过直接的Ca2+诱导的损伤。研究发现线粒体的Ca2+负荷超过其缓冲能力，会出现膜电位降低并破坏电子传递，导致ROS生成增加。原代海马神经元暴露于异氟烷12h可升高胞浆钙水平，增加线粒体内Ca2+蓄积，导致线粒体损伤ROS增加，这些改变可被细胞内钙螯合剂BAPTA-AM减弱。
（四）影响神经发育及突触形成
大脑发育过程中的快速突触形成期和大脑生长突增期是神经易损期，全身麻醉药暴露后最易出现神经毒性。啮齿类动物的这一关键期大约持续至出生后2～3周。对于恒河猴，此阶段大约始于妊娠期第115天，至出生后60d。而在人类中，此阶段从妊娠晚期开始，并持续至出生后2～3年，许多发育事件（例如神经发生、突触形成和神经元结构重塑）都发生在这一时期内。神经形成涉及多个连续步骤，包括神经干细胞（NSC）的增殖和分化。研究表明麻醉药可能通过影响NSC增殖、神经形成、突触形成和神经元存活来调节神经发育。线粒体和代谢变化被认为是干细胞分化过程的标志。ROS参与神经祖细胞（neural precursor cells，NPCs）增殖和分化的调控。超氧自由基阴离子的快速爆发即超氧闪光，可以调节小鼠胚胎NPCs的自我更新和分化。
线粒体在神经元胞体中生成，并在细胞质内移动分布于细胞内。因为神经元有多个隔室（如树突、轴突和突触）位于远离细胞体的地方，它们的发生发育在很大程度上依赖于适当的线粒体分布。线粒体功能障碍会损害突触的形成。研究发现幼鼠多次暴露于七氟烷可诱导突触丢失和线粒体功能障碍，并且平均突触前线粒体密度和平均突触密度呈正相关。研究指出，大鼠出生后七天即突触形成高峰期全身麻醉药暴露（异氟烷、氧化亚氮和咪达唑仑联合用药），引起下托神经元线粒体的迁延性损伤，包括线粒体显著增大和结构完整性受损，其复合物Ⅳ活性增加，线粒体形态发生受损，ROS增加，进一步导致抑制性突触神经传递的持久紊乱，进行的神经纤维网破坏和显著的神经突降解。
三、抗氧化应激药物
无论是ROS的直接作用还是间接抑制线粒体功能、诱导细胞凋亡、影响突触形成、干扰神经发生，越来越多研究证实了ROS参与并介导了吸入麻醉药发育期神经毒性的发生与发展，那么通过不同途径/靶点阻止或延缓ROS的过多产生与蓄积也许是预防或治疗吸入麻醉药发育期神经毒性的一种方法。
（一）ROS清除剂
用异氟烷处理人神经胶质瘤细胞U251和7日龄小鼠可破坏正常情况下的ATP平衡，导致细胞ATP水平不受控制地增加，随后ROS积累并导致细胞毒性。ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystine，NAC）能有效缓解异氟烷引起的ROS蓄积和神经毒性。此外，氢气作为ROS清除剂可选择性清除两种最具攻击性超氧阴离子OH-和ONOO-，进而抑制异氟烷诱导的氧化应激、线粒体功能障碍和ATP水平的降低来减轻异氟烷诱导的胱天蛋白酶-3活化和认知损害。
（二）NOX抑制剂
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）家族是各种组织中ROS生成的主要来源之一。这些酶能够将电子穿过质膜并产生超氧化物。新生小鼠七氟烷暴露脑中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶22phox亚基的表达增加，促进氧化应激，进而导致神经元损伤。夹竹桃素通过降低NOX浓度，减少神经元凋亡并降低细胞色素c浓度，保护其免受长期记忆障碍。氯胺酮可刺激超氧化物生成、NOX2的上调，进而导致海马和前额叶皮质中小白蛋白阳性中间神经元表型的丧失，并最终导致长期认知障碍，NOX抑制剂夹竹桃素处理能有效减轻这些异常。因此，调节NOX可能作为吸入麻醉药发育期神经毒性的潜在治疗靶点。
（三）线粒体功能靶向抗氧化剂
Boscolo等研究显示全身麻醉药（咪达唑仑、氧化亚氮和异氟烷）暴露使线粒体体积增大，线粒体结构完整性受损，复合物Ⅳ活性增加。大脑活性氧的浓度增加，损害了线粒体裂变和融合之间的平衡，从而引起线粒体过度裂变和形态发生障碍。与全身麻醉药处理的大鼠相比，同时给予恢复线粒体完整性的合成氨基苯并噻唑衍生物——普拉克索（pramipexole，PPX）的大鼠的脂质过氧化作用显著下调，线粒体完整性得以保留，神经元损失显著减少。Wu等的研究表明线粒体靶向抗氧化剂Elamipretide预处理不仅对氧化应激和线粒体损伤提供了保护作用，而且减弱了异氟烷诱导的认知缺陷。尽管ROS上调和线粒体功能障碍之间的时间关系仍有待确定，但吸入麻醉药诱导的发育性神经毒性的一个关键细胞靶点是线粒体，它们通过多种方式蓄积而受损，对发育中的神经元产生持久的不利影响。因而，维持线粒体功能可能是吸入麻醉药发育期神经毒性治疗的一个重要治疗方向。
四、小结与展望
综上所述，氧化应激可通过多途径影响吸入麻醉药发育期神经毒性的发生，多种抗氧化应激药物可减轻神经毒性。展望今后，对于氧化应激在吸入麻醉药神经毒性发病机制需要深入研究，有望在氧化应激反应的机制中寻找到改善全身麻醉药神经毒性的靶点。
（练婉怡 雷洪伊）
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