第一章　质谱技术在临床中的应用简介

质谱（mass spectrum，MS）是样品分子或原子在外部能量作用下电离或电离后进一步分解而生成碎片离子，这些离子在质量分析器（通常是电场或磁场）作用下按照带电粒子的质量对所带电荷之比值的不同而分离排列的图谱，并在此基础上进行各种有机物、无机物的定性和定量分析。质谱的形成过程是气态样品通过导入系统进入离子源，被电离成分子离子和碎片离子，由质谱分析器将其分离并按照质荷比大小依次进入检测器，信号经放大、记录得到质谱图。质谱仪包括进样器、离子化源、质量分析器、控制系统和数据分析系统。质谱仪的核心是离子源和质量分析器。离子源的种类很多，在真空状态下工作的离子源有电子轰击源（electron impact ion source，EI）、化学电离源（chemical ionization，CI）、激光表面解析源（laser desorption，LD）、场解析（软电离）源（field desorption，FD）、快原子（快离子）轰击源（fast atom bombardment，FAB）等；在低压下工作的离子源有电（离子）喷雾（electron/ion spray，E/IS）、电感耦合（inductively coupled plasma，ICP）等离子源。质量分析器的主要类型有磁偏转质谱、四级杆质谱（quad）、离子阱质谱（IT）、飞行时间质谱（TOF）、傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR）等。不同的分析器与离子源之间有多种组合，构成不同的质谱仪。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，作为理想的色谱检测器，不仅特异性强，而且具有极高的检测灵敏度。自1983年McLafferty等开发串联质谱技术（MS/MS）以来，串联质谱已成为一种成熟的技术，在许多领域特别是在医药临床研究领域发挥着巨大作用。串联质谱法是指质量分离的质谱检测技术，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物进行定性、定量。串联质谱有分离、结构解析同步完成的特点，能直接分析混合物组分，有高度的选择性和可靠性，其检测水平甚至可以达到皮克（pg）级，因此用串联质谱可解决医药领域中的许多问题。色谱-质谱联用技术结合了分离能力强、应用范围广的色谱和灵敏度高、准确性好的质谱优点，同时具有对检测样本处理要求不高、灵敏度高、线性范围宽等优点。根据前端色谱仪的不同，色谱-质谱联用技术包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）和毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等。根据后端质谱仪的不同可分为四级杆串联质谱（QQQ/MS）、离子阱质谱（IT/MS）、飞行时间质谱（TOF/MS）、傅里叶变换质谱（FT/MS）等。色谱与质谱部分可以根据需要进行不同的组合，构成不同类型的质谱联用仪，如气相色谱-四级杆质谱联用仪（GC-QQQ/MS）、液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（LC-QTOF/MS）等。

一、质谱技术在生物大分子分析中的应用

由于生物大分子如蛋白质、酶、核酸和多糖等具有非挥发性、热不稳定且相对分子质量大等特性，使传统的电离子轰击、化学离子源等电离技术的应用受到极大限制。20世纪80年代出现的软电离技术为质谱在生物大分子的研究领域中开辟了广阔前景。软电离技术的出现，使生物大分子转变成气相离子成为可能，大大提高了质谱的测定范围，改善了测量的灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使质谱更适合于分析生物大分子聚合物，如蛋白质、核酸和糖类，开创了质谱分析研究生物大分子的新领域。软电离质谱主要包括电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）、基质辅助激光解析电离质谱（matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-MS）、快离子轰击质谱（fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS）、离子喷雾电离质谱（ion spray ionization mass spectrometry，ISI-MS）、大气压电离质谱（atmospheric pressure ionization mass spectrometry，API-MS）。以上软电离质谱技术中，ESI-MS和MALDI-MS研究最多，应用也最广泛。其可以提供快速的、易解的多组分的分析方法，且灵敏度高、选择性强、准确性好，尤其是在蛋白质组学中的应用越来越广泛。蛋白质组学（proteomics）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学领域中的新学科。基于质谱发展起来的平台有利于研究细胞内蛋白质组分数量的变化，目前质谱越来越多地被用于蛋白质或肽的相对或绝对定量的研究中。质谱可以用来研究蛋白质化学修饰的关键技术，可以定位修饰位点、定量化学修饰蛋白及检测新型结构。定向蛋白质组学是基于质谱技术快速检测目标蛋白的技术，基于质谱的鸟枪蛋白质组学研究是将蛋白质酶解、片段化成肽片段进行质谱分析。质谱在功能蛋白质组学中也有应用。质谱蛋白质组学方法可在鉴定细胞、亚细胞或有机体蛋白质中发挥重要作用，并可提供细胞生物过程和信号传导途径中的重要信息。质谱在核酸和蛋白质的序列分析、结构分析、分子量测定和各组分的含量测定中也有应用，还可用于非共价键结合体如抗原-抗体结合的测定。

二、质谱技术在小分子分析中的应用

在小分子生物标志物的临床检测方面，质谱分析的项目主要包括氨基酸、脂肪酸、有机酸及其衍生物、单糖类、前列腺素、甲状腺素、胆汁酸、胆固醇和类固醇、生物胺、脂类、碳水化合物、维生素、微量元素及某些微生物的鉴别等。

GC-MS、GC-TOF/MS不仅能够检测到氨基酸、核苷酸、有机酸、胺类、糖类等极性大的代谢物，而且还能够检测到脂肪酸等极性小的代谢物。也就是说，生物体内的三羧酸循环、糖酵解、磷酸戊糖代谢、尿素循环、脂肪酸代谢、多种氨基酸代谢等多条主要代谢路径的相应成分均能得到检测。因此GC-MS在代谢组学研究中得到了迅速发展，同位素稀释GC-MS也已经成为定量和定性分析小分子的强有力的临床工具，为众多生物小分子的检测提供参考方法。该方法的特点是先用气相色谱对样品进行分离，使绝大部分的样品基质和干扰物质与被测组分相分离，被测组分在载气的带动下经接口进入质谱，从而避免了复杂的样品基质对测定的干扰，保证了质谱定性的可靠性，极大地提高了定量测定的准确性。液相色谱主要有高效液相色谱（HPLC）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）等形式。其中超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（UPLC-QTOF/MS）与传统的HPLC相比，具有分析速度更快、分离效率更高的优点，近年来逐渐成为代谢组学研究的常用方法。毛细管电泳-串联质谱法（CE-MS）兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，基本原理是根据在电场作用下离子迁移速度不同而对组分进行分离和分析。CE-MS可检测多种生物样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液、组织及实验动物活体等。与LC-MS和GC-MS相比，CE-MS的分辨率更高、分析速度更快、所需检测的样品和底液量更少。

三、质谱技术在临床疾病诊断中的应用

生物体是体液、细胞和组织中的代谢物处于动态平衡的完整体系，当机体产生疾病时，病理状态下的机体会引起一些内源性代谢物的种类及浓度发生改变，应用代谢组学技术对其进行全面分析，可为临床诊疗提供依据。

代谢组学（metabonomics）是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的以定量描述生物体内的代谢物多参数变化为目标的新兴“组学”，是系统生物学的重要组成部分。其关注的是代谢路径中相对分子质量在1000以下的小分子代谢物的变化，反映受外界刺激或遗传修饰下细胞或组织的代谢应答变化。色谱-质谱联用技术对于样本中浓度相差大的代谢化合物可达到很好的检测效果，已成为代谢组学研究技术平台中愈加重要的方法。首先，质谱联用技术在肿瘤代谢组学的研究中得到了广泛应用。由于遗传学和表观遗传学的基因突变，从而导致肿瘤细胞的代谢表型发生改变，其异常代谢所产生的中间产物和终产物均可作为肿瘤发生和发展的标志物，因此运用代谢组学技术从机体的代谢途径中寻找肿瘤特异性代谢产物已成为国内外学者研究的热点。应用生物质谱技术检测肿瘤标志物是临床诊断肿瘤的重要检验方法。由于恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，所以人们一直在研究其早期诊断方法，肿瘤标志物的检测就是其中的一个主要方法。通过LC-MS法对健康女性和患有卵巢上皮细胞癌的患者血清进行代谢组学分析，发现27-nor-5β-cholestane-3，7，12，24，25-pentolglucuronide（CPG）可以作为潜在的肿瘤标志物的代谢产物，与CA125相互补充，有利于卵巢上皮细胞癌的早期诊断。采用GC-MS法对肺癌患者及其他肺部疾病患者的血清及尿液进行代谢组学分析，发现血清中有13种差异代谢标志物、尿液中有7种差异代谢标志物。利用GC-TOF/MS法对肾细胞癌患者进行代谢组学分析显示，与正常组织相比，原位肿瘤组织存在α-生育酚、马尿酸、肌醇、1-磷酸果糖等代谢异常；远端转移肿瘤组织存在花生四烯酸、游离脂肪酸、脯氨酸等代谢异常。检测尿液中的α-生育酚有可能成为肾细胞癌肿瘤组织与非肿瘤组织的鉴别方法，得到18种尿液代谢标志物，其中包括辛二酸、庚二酸、乙二酸、甘氨酸、木糖醇、尿素、磷酸盐、丙酸、嘧啶、苏氨酸、丁二酸、丁酸、三羟基戊酸、次黄嘌呤、酪氨酸、阿拉伯呋喃糖、羟基脯氨酸二肽和木糖酸。结合血清传统标志物甲胎蛋白的检测结果建立诊断模型，大大提高了临床诊断的准确性。

其次，质谱联用技术在肝肾疾病代谢组学研究中也有应用。通过UPLC-QTOF/MS技术和多变量数据分析证实，纤溶酶LPCs是区别酒精性肝损伤和肝癌的生物标志物。采用UPLC-TOF/MS研究暴露于不同浓度的全氟辛酸（PFOA）72小时的正常人L-02肝细胞内代谢谱的变化，筛选出18种与全氟辛酸毒性密切相关的生物标志物，包括肉碱和酰基肉碱、核苷及其同源物、氨基酸及其同源物等。Oresic M等应用UPLC-MS与GC-TOF/MS技术，分别对精神分裂症患者血浆内的脂质和小分子极性代谢物进行分析表明，患者体内的糖代谢和脯氨酸代谢异常可能是与该病有关的两条代谢途径。采用UPLC-QTOF/MS技术对孤独症儿童的血清进行代谢组学分析，共鉴定出14个潜在生物标志物，其中鞘脂类和溶血磷脂类物质在孤独症儿童组明显增多，而不饱和脂肪酸和脂酰肉毒碱明显减少。用UPLC-QTOF/MS技术分析高尿酸血症患者的血浆代谢物图谱，发现有6种质荷比较小的代谢物是区分高尿酸血症患者与健康人群的潜在标记物，主要包括脂肪酸和短肽等。

质谱联用技术在中医证候代谢组学中也有较好的应用。从整体观念来看，证候是由外源性刺激（外邪）或基因变异（内因）所致的病理变化过程，该过程使生物代谢网络和细胞产生的内源性物质的种类、浓度、相对比例发生扰动，体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。而代谢组学正是通过考察这种改变来揭示病理状态变化规律，非常符合中医整体观念和辨证论治特点的需要。通过GC-MS及模式识别为主的代谢组学方法对慢性心力衰竭（CHF）肾阳虚证患者的代谢模式进行了研究。通过PCA模式识别，慢性心力衰竭肾阳虚证组、非肾阳虚证组与正常组的主成分积分（枸橼酸、丙氨酸、3-甲基戊烯二酸、丙胺、组胺）在空间分布上明显分开，证实慢性心力衰竭肾阳虚证患者、非肾阳虚证患者和正常人具有不同的代谢模式。用LC-TOF/MS对高血压肝阳上亢证患者进行主成分分析，通过Metlin数据库鉴定相关代谢物及代谢通路，结果PCA得分图中健康志愿者的数据离散度较大，而阴阳两虚证组和肝阳上亢证组的数据则呈聚集，两证候组的数据在空间上分离良好，组间存在较大差异，共鉴定出6种代谢物：雌二醇、白三烯、葡萄糖神经酰胺、神经酰胺、甘油三酯及甘油二酯，或能成为两种高血压证候的鉴别点。采用GC-MS对冠心病（CHD）心血瘀阻证组、CHD非心血瘀阻证组、健康对照组进行血浆代谢产物PCA分析。通过PCA积分三个实验组分别聚于椭圆形散点图的三个区域，花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、枸橼酸、β-羟基丁酸、油酸、葡萄糖、丙氨酸为CHD心血瘀阻证患者血浆中的重要指标性代谢产物。

遗传性代谢疾病（inherited metabolic diseases，IMD）又称为先天性代谢缺陷疾病（inborn errors ofmetabolism，IEM），是指由于基因突变引起酶缺陷、细胞膜功能异常或受体缺陷而导致机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏引起一系列临床症状的一组疾病。新生儿疾病筛查（newborn screening）是指在新生儿期对某些危害严重的先天遗传代谢性疾病进行群体筛检，使患儿得到早期诊断和治疗，避免智能残疾的发生，提高人口质量。此类疾病在新生儿期甚至在小婴儿期常缺乏特异性症状，一旦出现症状患儿已发生中枢神经系统的不可逆性损伤，失去了最佳治疗时机。而患儿在新生儿期血液内的生化、代谢等指标已有变化，因此可利用实验室检测方法作出早期诊断。新生儿疾病筛查是现代预防医学的重要内容，对优生优育、提高人口素质具有深远而积极的意义，也是从根本上降低出生缺陷、提高人口质量的重要措施之一。从苯丙氨酸的细菌抑制法至荧光定量检测，干血斑促甲状腺激素（TSH）检测法中的放免法、酶联免疫吸附法（ELISA）、时间分辨荧光免疫法（DELFIA）的演进，到干血斑的MS/MS分析技术，新生儿疾病检测技术不断改进，可检测的病种逐渐增多，检测效率和准确度也大大提高。串联质谱技术可通过一次进样检测多种疾病，极大地拓展了IMD筛查的种类。目前已可以用此技术检测的IMD包括氨基酸代谢紊乱、有机酸尿症、尿素循环障碍及脂肪酸氧化缺陷（酰基肉毒碱缺乏）等。

四、质谱技术在治疗药物监测中的应用

治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）是指通过各种现代测试手段，测定血液或其他体液中的药物及其代谢物的浓度，探讨患者体内的血药浓度与疗效及毒性反应的关系，从而确定有效及毒性血药浓度范围。应用药动学原理调整给药方案，包括最适合的剂量、给药间隔及给药途径，提高疗效和减少不良反应，达到安全、有效的个性化治疗的目的，以避免体内药物浓度过低所致的治疗失败或体内药物浓度过量导致毒性反应。需要进行临床监测的药物主要包括以下几类：第一类为治疗指数低、毒性大的药物，如地高辛、氨茶碱、环孢素、氨基糖苷类抗生素、锂盐等。第二类为药物动力学呈非线性特征的药物，这类药物随剂量增大血药浓度可不成比例地猛增，并伴以半衰期明显延长，如苯妥英钠、普萘洛尔、阿司匹林等。第三类为需长期使用的药物，易出现慢性中毒或达不到血药浓度，常不易觉察，如抗癫痫药等。第四类为需要优化个体化给药方案的药物，如患有肝、肾、心脏和胃肠道等脏器疾病的患者使用的药物，这类药物在体内的药物动力学参数可发生显著改变。如胃肠道疾病可影响口服药物的吸收；心力衰竭患者由于肝、肾血流量减少而影响药物的代谢；肝功能不良者可使药物的代谢速率降低，并减少与血浆蛋白的结合；肾功能不良可影响药物的排泄。因此，这些患者应进行血药浓度监测，随时调整给药方案。第五类为过量后中毒症状与原疾病本身的症状类似的药物，如苯妥英钠中毒引起的抽搐与癫痫发作症状相似，不易区别，这类药物需要进行药物监测。第六类为合并用药时常需要进行药物监测。由于药物的相互作用而引起药物的吸收、分布或代谢的改变，通过血药浓度监测，可以有效地作出校正。

原有药物监测主要使用免疫化学技术和高效液相色谱技术。临床上多采用免疫化学技术，该技术简单易行，但是所测定的药物种类比较少；高效液相色谱技术测定的药物种类较多，但是定性的可靠性差，专属性比较低。色谱-质谱联用技术监测药物准确、快速、灵敏度高，几乎可以用于所有药物的监测，如强心苷、抗心律失常药、抗癌药、免疫抑制剂、抗生素等，所以色谱-质谱联用技术在治疗药物监测中将具有广泛的应用前景。

五、质谱成像技术在临床上的应用

质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）是一种新型的分子成像技术，它将质谱的离子扫描过程与专业的图像处理软件相结合，对样本表面分子或离子的化学组成、相对丰度及空间分布情况进行全面、快速的分析，应用这一技术，可以直接从生物组织切片表面获得多种蛋白质或小分子代谢物的空间分布信息。这种原位分析技术的原理是利用激光或离子束使组织切片表面的分子离子化，然后通过质谱测定这些离子化分子的质荷比（m/z），再由软件重构出分析物在组织中分布的图谱。该技术最早于1997年被应用于研究生物组织中蛋白质的分布。目前MSI技术已广泛用于蛋白质识别、生物标志物发现、医学诊断等研究。MSI技术在疾病机制的研究中也有广泛的应用，例如对阿尔茨海默病患者的脑组织进行质谱成像分析发现两个具有特征分布的多肽，多肽m/z4330.9主要集中分布于颅顶骨、枕骨的皮质突出部，多肽m/z4515.1主要集中于海马区。进一步鉴定这两个组分，发现它们均为淀粉多肽。阿尔茨海默病的病理特征是在老年斑和血管壁上会出现淀粉多肽的沉积物，因此，研究者推测这些多肽的分布与阿尔茨海默病的发病机制有关。该技术可在无标记的条件下研究蛋白质或代谢物在组织中的分布，有助于了解疾病产生、转移和预后的机制。MALDIMSI技术还可用来划分肿瘤组织与周围正常组织的界限，可作为染色得到的组织学信息的补充。通过研究小叶状乳腺癌、胃肠道的环状体癌、胆管癌等生物组织中的癌细胞位置，当在显微镜下见不到明显可辨认的病理区域时，可使用质谱成像技术找出癌细胞侵袭区域，指导手术切除。

总之，自从质谱技术应用到临床以来，便以高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快、样本前处理简单的优势显示出巨大的生命力，尤其和气相、高效液相色谱仪的联用极大地扩展了质谱技术在临床中的分析范围。

（吴立军）

参 考 文 献

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