第四节　质谱技术在异戊酸血症诊断中的应用

一、异戊酸血症简介

异戊酸血症（isovaleric acidemia，IVA）是由于异戊酰辅酶A脱氢酶（isovaleryl-CoAdehydrogenase，IVD）先天性缺陷所致的一种罕见的遗传代谢病，属于有机酸血症的一种，系常染色体隐性遗传病，是由于亮氨酸分解代谢不足导致异戊酰基-辅酶（CoA）脱氢酶缺乏，从而引起自由异戊酸、3-羟基异戊酸、N异戊酰基甘氨酸、异戊酰基肉毒碱（Isovaleryl carnitine，C5）在体内的积累。与此缺陷相关的各种临床症状包括进食障碍、呼吸急促、呕吐、精神萎靡、嗜睡、昏迷和脱水。这种缺陷的主要特征是异戊酰基甘氨酸的尿排泄。IVA发病时亮氨酸分解过程中的分解代谢产物异戊酰辅酶A的正常代谢途径被阻断，导致旁路代谢生成的异戊酰甘氨酸和3-羟异戊酸在体内聚集，侵害患儿的神经与造血系统，导致发育迟缓、运动失调、昏迷甚至死亡。

二、目前临床诊断异戊酸血症的方法

IVA患者中超过半数是新生儿期发生急性脑病，另外半数表现为婴儿和儿童期反复呕吐、嗜睡或昏迷及智力发育落后，根据这些临床症状可初步对该疾病进行诊断。近年来，随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的发展，对血酰基肉碱谱和尿有机酸的监测变得更加方便。

三、质谱技术在异戊酸血症诊断中的应用

近年来，串联质谱分析技术在诊断该疾病的干血滤纸片中氨基酸和酰基肉碱水平检测分析过程中能够提供重要的技术支持，我国在2002年开始利用MS/MS方法对新生儿代谢紊乱疾病进行筛查和诊断，并建立了可靠的方法。

实例：

使用串联质谱方法筛选临床患有先天性新陈代谢障碍的患者

样品来源：

样品来自于13例先天性代谢障碍病患者，平均年龄为1.1岁（1天～11岁）。

实验仪器：

API2000串联质谱仪，购自Applied Biosystems；高效液相色谱仪为Agilent1100。

质谱条件：

对于氨基酸，中性丢失扫描用m/z 102，使用的扫描范围为m/z 210～502，产物离子用m/z 85进行前体扫描；对甘氨酸、鸟氨酸、精氨酸和瓜氨酸进行多反应检测。

样品前处理方法：

（1）GC-MS分析方法：

4～7天目标疾病的新生儿筛查后采集尿液标本、血液标本，采用Guthrie法处理。液体尿液或GC-MS测定的滤纸尿液样品的准备程序同本章第二节中的样品处理方法。

（2）LC-MS分析方法：

样品制备是将每个干血滤纸样品放到3.2mm直径的穿孔圆盘中并放置在96孔滤板中，每孔加100μl含有内标的甲醇，室温20分钟后离心，然后将液体加到96孔聚丙烯板中，50℃氮气流下吹干。随后每孔加60μl丁烷氯化氢，用聚四氟乙烯膜覆盖住板子，65℃孵育15分钟。然后每孔中注入100μl乙腈-水（4∶1，V/V），准备进样。

数据处理：

用ChemoView 1.2软件依据内标指定值自动分析氨基酸和酰基肉毒碱水平。

结果分析：

质谱图以及质谱检测的特征离子分别如图2-4和表2-4所示。

图2-5为使用L-肉碱和蛋白质控制饮食治疗前和治疗中的患异戊酸血症的新生儿血液斑点中的短或中长链的酰基肉碱的测定情况。注意乙酰肉碱（C2）浓度的正常值和异戊酰2-甲基丁酰肉毒碱（C5）、稳定同位素标记内标（IS）浓度的变化，以及正常对照组的血液斑点（母离子扫描为m/z 99）。

根据以往的研究可知异戊酸血症患者的尿液中会产生大量的N-异戊酰基组氨酸、赖氨酸、色氨酸以及乙酰色氨酸，这些氨基酸的结合可能造成显著的异戊酸血症的临床症状。血液串联质谱分析显示，C5酰基肉碱水平明显升高，不伴有其他酰基肉碱或氨基酸异常。其父母血液中的氨基酸和酰基肉碱谱未见明显异常。患儿的尿液气相色谱-质谱有机酸分析显示异戊酰甘氨酸明显升高。结合患儿的临床症状和实验室检查，以及MS-MS和GC-MS结果，临床诊断为异戊酸血症（表2-5）。