第四节 乳腺癌和前列腺干细胞与外泌体
一、乳腺癌与前列腺癌细胞中存在癌干细胞
乳腺癌与前列腺癌分别是世界范围内女性与男性最常见的恶性肿瘤，它们的发病率在逐渐增加。中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，我国近年来乳癌发病率正以每年3%的速度递增，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。中国主要大城市10年来乳腺癌发病率增长了37%，死亡率增长了38.9%，农村死亡率增长了39.7%。西方妇女乳腺癌的发病人数高峰期为50～55岁，但中国女性的乳腺癌发病年龄，却在40岁左右。近20年时间，我国前列腺癌的发病率增加了3.3倍。
Al-Hajj等（2003年）首次发现并分离了乳腺癌干细胞，运用细胞表面标志物ESA+/CD44+/CD24-在乳腺肿瘤细胞中筛选出一个细胞亚群。这个细胞亚群在体内具有极强的致瘤和侵袭转移能力。将200个ESA+/CD44+/CD24-或1000个CD44+/CD24-细胞接种在联合重症免疫缺陷小鼠（NOD/SCID mice）上，即可形成肿瘤。相反，未经细胞表面标志筛选的乳腺肿瘤细胞，至少需要50 000个才能在NOD/SCID小鼠上形成肿瘤。目前，CD44、CD24、ESA已经成为广泛认可的乳腺癌干细胞标志物。乳腺癌细胞中存在一部分具有自我更新、多向分化潜能以及高度致瘤能力的细胞亚群，称为乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells）。
2003年，Rupesh等用Hoechst33342染色法分离出了前列腺干细胞。Garin 等证实大约有1%的人前列腺基底细胞表达细胞的表面标志CD133，表型为α2β1hi/CD133+的细胞拥有很高的体外增殖潜能并能在免疫缺陷的雄性裸鼠身上重建前列腺腺泡。他们指出，表达α2β1hi/CD133+表型的细胞具有等同于前列腺干细胞的特性，能在体外形成和维持前列腺上皮。2005年，Collins等报道从前列腺癌组织中成功分离出表型为CD44+/α2β1hi/CD133+的前列腺癌干细胞（大约为0.1%）。通过长期培养表明，这部分细胞在体外有很高的增殖潜能并能形成二次克隆，也只有肿瘤来源的CD133+细胞才有自我更新、无限增殖和分化的能力，并且可以在非雄激素依赖的条件下存活。终于证实CD44+/α2β1hi/CD133+表型细胞即为前列腺癌干细胞（PCSC）。
二、乳腺癌与前列腺癌干细胞释放外泌体
外泌体是在细胞间通讯中起重要作用的小分泌囊泡，可由多种类型的细胞分泌，在细胞间起着质膜交换及转运蛋白质、mRNA、microRNA和细胞器等生命活性物质的作用。此外，外泌体还可通过改变基因调控网络或表观遗传重组来调控正常的生理过程。最近的研究发现，干细胞分泌的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA和蛋白质，在调控组织再生方面发挥着重要作用。
各种类型的细胞分泌外泌体受多种因素影响，如一些化学物质（包括药物）和应激反应可能促进细胞分泌外泌体。鱼藤酮（rotenone）是自然植物的产物，它是豌豆家族成员，分子结构属于异黄酮化合物（isoflavones compounds），对鱼类有毒性。
Kumar等（2014）为研究鱼藤酮（rotenone）对癌干细胞外泌体的诱导释放，用鱼藤酮（40μM）处理了乳腺癌与前列腺癌干细胞，随后在电子显微镜下观察细胞。观察显示，虽然不加药的乳腺癌与前列腺癌干细胞培养液中也存在外泌体；但鱼藤酮处理的干细胞培养液中显示出更多的外泌体（图9-9），说明鱼藤酮可以诱导癌干细胞释放外泌体。
上述实验结果表明：乳腺癌与前列腺癌干细胞能释放外泌体，而在鱼藤酮的作用下癌干细胞释放更多的外泌体。在一些机体，鱼藤酮能诱导自噬性溶酶体和线粒体损伤，因此，在癌干细胞中外泌体的释放能诱导自噬性溶酶体。
三、乳腺癌与前列腺癌干细胞外泌体的标志
前面已经提到乳腺癌与前列腺癌干细胞能释放外泌体。为了证实这些外泌体是否是从乳腺癌及前列腺癌干细胞中分泌的，可应用荧光抗体观察外泌体的标志物，如CD9、CD81、CD63 与 Alix。以DAPI染色技术，染色癌干细胞的DNA。Kumar等在荧光显微镜下，观察到乳腺癌与前列腺癌干细胞分泌的外泌体中存在CD9、CD81、CD63 及 Alix生物标志物；而在鱼藤酮处理的乳腺癌与前列腺癌干细胞分泌的外泌体中存在CD9、CD81、CD63 及Alix生物标志物的量比未处理的癌干细胞多3～4倍。外泌体的DAPI染色，显示从癌干细胞释放的外泌体中含有DNA。这些结果表明：癌干细胞分泌的外泌体带有一些细胞信息能帮助理解肿瘤发生、发展和转移的特点。
四、癌干细胞释放的外泌体中CD9、CD63、CD81 和TSG101 mRNA的表达
外泌体表面带有四跨膜家族蛋白（tetraspanin），如CD63、CD9、CD81和TSG101，其主要由造血细胞、淋巴细胞及噬菌体分泌至体液，此外，上皮细胞和肿瘤细胞等亦会分泌大量的外泌体。这些四跨膜家族蛋白也可作为鉴定Exosome的生物标志物。
Kumar 等为了分析乳腺癌和前列腺癌干细胞分泌的外泌体，他们以qRT-PCR方法检测了乳腺癌和前列腺癌干细胞外泌体的CD9、CD63 、CD81 和TSG101 mRNA的表达。结果显示：乳腺癌和前列腺癌干细胞外泌体均有CD9、CD63、CD81 和TSG101 mRNA表达，但是，鱼藤酮处理的乳腺癌和前列腺癌干细胞外泌体，其中CD9、CD63、CD81 和TSG101 mRNA表达明显高于未用鱼藤酮处理的乳腺癌和前列腺癌干细胞外泌体。这些结果在mRNA水平证明癌干细胞释放外泌体。这个重要信息有助于理解与制定预防和治疗策略。