第二节 肺癌干细胞与外泌体
肺癌是世界癌症死亡率高的肿瘤，尽管医学的发展和外科手术的进步成果显著，但患者的生存率仍停留在15%。肺癌干细胞（LCSCs）的鉴定是一个活跃的研究领域和发展新治疗策略的需要。25年前，有人首先报道：人肺癌中存在致克隆的细胞群。从肺腺癌和小细胞肺癌患者临床标本分析，这些标本中含有少量细胞（<1.5%），能在软琼脂形成克隆。选择软琼脂形成的克隆，接种到裸鼠，能够形成肿瘤，肿瘤具有患者原发肿瘤标本的生物学特征。因此，支持肺癌中存在肿瘤干细胞。
一些研究发现肺癌干细胞释放可溶性因子到细胞外空间，这些因子称为外泌体，它可能转递生物信息从供体细胞到受体细胞。因此，肺癌干细胞的发现和鉴定其生物学特性的可能性，可提供重要的转化手段，改善肺癌患者临床治疗结果。
肿瘤干细胞表达表面标志物CD133蛋白，CD133蛋白标志物也似乎存在于肿瘤干细胞来源的外泌体中。假如CD133被认为是干细胞标志物，为了理解肿瘤干细胞和肿瘤微环境之间相互联系以及肿瘤干细胞对放化疗抵抗机制的研究，CD133蛋白在肿瘤微环境中的作用就很重要。
外泌体具有确定的细胞膜和细胞质蛋白。外泌体的生理功能仍然是一个需讨论的问题，但是，从不同实验系统提供的结果表明：外泌体与多种生物学过程有关，因为细胞培养和生物体液中均含有不同类型脂膜，它是高质量外泌体纯化的关键。文献报道，外泌体分离步骤已经建立。为了从不同肺癌干细胞获得外泌体，并取得高产量的外泌体，L.Brunetto对文献发表的分离外泌体的方案进行了一些修改。过滤/超速离心步骤用于纯化外泌体囊泡。主要的步骤是将人肺癌干细胞培养在无血清培养基中，然后收集上清液，以×300g离心10分钟，再以×3000g离心30分钟，通过0.22μm滤膜过滤，除去不纯物，如细胞的碎片。下一步是浓缩上清液，上清液用超速离心机× 150 000g离心1小时，沉淀物用11ml PBS液洗；再以超速离心机×150 000g离心1小时，收集沉淀物（图9-4）。最后，含有外泌体的沉淀物重新悬浮在小量（50～100μl）的PBS液内，为以后用于外泌体蛋白定量、功能分析和western blot分析。
免疫沉淀技术可以证实CD133存在于外泌体的表面，首先进行以慢病毒感染HEK293T细胞，获得稳定转导变异的HEK293TGFP对照细胞和HEK293T Prom1GFP细胞（Proml基因编码CD133蛋白），经FACS分析具有高百分比GFP阳性细胞，表明HEK293T细胞已成功转导变异。为了进行免疫沉淀技术分析，分别收集培养3～5天的HEK293T Prom1GFP细胞和HEK293TGFP细胞的等量培养液，并加入CD133 抗体，外泌体的标志物，如TSG101 与Rab5b，以及IgG1抗体共同培育。只有应用CD133 抗体的过表达CD133细胞显示典型的外泌体的标志物TSG101与Rab5B（图9-5）。Prom1上清培养液与 CD133抗体作免疫沉淀技术分析，显示有大量CD133蛋白。在原代肺癌细胞LCSL136细胞中，应用CD133抗体、LCSC136GFP及LCSC136Prom1GFP高表达细胞培养液进行上述同样的实验，获得相似的结果。这些实验首次表明：肺癌干细胞来源的外泌体富有CD133蛋白，此蛋白是干性的标志。此外，外泌体中集聚大量CD133提示CD133蛋白在外泌体生物功能中的生理作用。
细胞—细胞的通讯有几种方式，包括化学受体介导、直接细胞—细胞接触、细胞—细胞突触。Brunet 提出另外细胞—细胞通讯的机制，即通过外泌体转递RNA。免疫荧光实验和FACS分析发现培养上清夜中的外泌体囊泡能转递CD133 蛋白和遗传物质从表达到非表达的细胞。
小结：肺癌中存在肺癌干细胞（LCSC），实验证明LCSC能分泌外泌体。外泌体是一种有活性功能的囊泡，它表面存在的CD133蛋白可能在信息转运中起决定作用。细胞之间的蛋白质和遗传通讯可能是产生在微环境中，但也可能产生在一定的距离。此外，CD133蛋白是很多实体肿瘤“干性”的标志物，它的真正功能有待进一步研究。
