第二章 一般毒性试验

第一节 急性毒性实验

Ⅰ 经口急性毒性实验

一、目的

化学毒物经口急性毒性实验是研究化学物毒性效应的基本实验。本次实习的目的是学习急性毒性实验的实验设计原则，学会动物分组方法，掌握经口灌胃技术和中毒症状的观察。

二、原理

选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。一次或24h内多次给予受试物后，了解动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量（LD50），并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。

三、内容

（1）健康小鼠的选择，性别的辨认。

（2）称重、编号和随机分组方法。

（3）受试化学物溶液的配制。

（4）小鼠经口灌胃操作技术。

（5）毒性体征的观察、LD50计算和毒性分级。

四、材料和试剂

1．实验动物

健康成年昆明小鼠60只，体重22g～24g，雌雄各半。

2．器材

动物称（感应量0.1/1000g）、灌胃针（小鼠用）、注射器（1ml）、刻度吸管（0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ml）、容量瓶（10ml）、烧杯（10、250ml）、滴管、编号笔、小瓷盘、动物笼。

3．试剂受试物

克百威，苦味酸酒精饱和液。

五、操作步骤

（一）健康小鼠的选择（见第一章第二节），本次实验提供健康小鼠。

（二）性别辨认（见第一章第二节）

（三）小鼠称重、编号与分组

1．称重

称量小鼠体重的秤，其感应量需在0.1g以下，并经过校正。称量时注意轻抓轻放，避免激惹小鼠，等小鼠安静后记录体重读数，以g表示。

2．编号

染色法编号（见第一章第二节）。

3．分组

体重均衡法分组（见第一章第二节）。

（四）剂量设计

本实验设6个剂量组，设计方案如下：见表2-1。

（五）受试物的配制

实验给药的剂型，可视毒物的溶解性能，采用水溶液、混悬液、油剂或乳剂。本次实验用水溶液。

非吸入染毒实验，各剂量组多按单位体重给予等容量药液的方法给药，故需先确定单位体重给药容量（小鼠灌胃通常用0.1～0.2m1/10g体重），然后按实验设计的最大剂组药液浓度，计算配制所需的毒物量，配成第Ⅰ号药液，再按设计的组距，逐组稀释，配制出所需组数的药液。

1．克百威灌胃液的配制，按照上述设计的6个剂量组：

最大剂量组为100mg/kg体重（1mg/10g）

设给药容量为0.2m1/10g体重，则药液浓度应为1mg/0.2m1（5mg/ml）。

配制100m1药液需受试物的量为：5mg/m1×100m1=500mg

准确称取克百威500mg，用少量蒸馏水溶解后，移入100m1容量瓶，然后加蒸馏水稀释至刻度，此溶液浓度为5mg/ml（实验教师已配好）。余下各组需学生自行配制。

（六）灌胃操作

小鼠灌胃法（见第一章第二节 实验动物的染毒途径和方法）：采用专用小鼠灌胃针，安装在1ml的注射器上，吸取所需的克百威溶液，左手抓住小鼠的双耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧，将小鼠固定成垂直体位，腹部面向操作者。注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。注意要点：①小鼠一定要固定好。②头部和颈部保持平展。③进针方向正确。④一定要沿着口角进针，再顺着食管方向插入胃内。⑤决不可进针不顺就硬向里插。

一般进针深度小鼠为2.5～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。为了验明是否已正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出，表明已插入胃中；如有大量气泡，则提示误插气管，应抽出重插。随后将受试物溶液注入。灌胃容量小鼠通常为0.2～1ml，大鼠为1～4ml，豚鼠为1～5ml。

（七）中毒体征和动物死亡情况观察和LD50计算

1．中毒症状染毒后注意观察毒性体征和死亡情况

高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即刻密切观察。观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡数量和时间及死亡前的特征。根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。按照实验结果，填写急性毒性实验记录表。染毒时间2小时。

2．LD50计算

采用改进寇氏法求出LD50及95%的可信限范围，计算方法见附录。

六、结果评定

根据小鼠中毒体征、死亡时间和特征、LD50，参照农药急性毒性分级（表2-3经口LD5）0进行评定，判断该受试物的毒性大小及毒性特征。

七、注意事项

（1）注意自我保护。

（2）灌胃前，各组受试物溶液均应充分混匀。

（3）灌胃时，推进速度不能太快或太慢，以免动物将药液呕出或因挣扎而伤害上消化道的黏膜。

（4）应选用针尖圆钝的灌胃针头进行灌胃。

（5）中毒死亡及脱臼处死的小鼠，装进塑料袋（注意不要夹带任何杂物放进塑料袋），送到动物饲料准备室集中放到专用纺织袋，置于冰柜冷冻贮存待销毁。

（6）按规定方法销毁剩余受试物。

八、实验报告

实验报告应包括以下内容：

（1）实验动物的种属、品系、性别及来源。实验前动物禁食和健康状况。

（2）实验动物体重和随机分组情况。

（3）受试物的名称、来源、纯度、性状等情况。

（4）受试物的配制和溶媒。

（5）详细描述实验观察的中毒表现和死亡情况等（表2-4）。

（6）LD50的计算方法和结果。

（7）受试物的毒性分级、分级依据和结果评价。

九、附录LD50（LC50）计算方法：改进寇氏法

改进寇氏法是利用对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法，又称Karber法或平均致死量法。该法计算简便，准确率高，是较为常用的方法。本法要求每个染毒剂量组动物数要相同，各剂量组组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率呈<20%，最高剂量组死亡率>80%。

计算公式如下：

m=xk-（i∑p-0.5）

式中：m∶lgLD50

i：相邻两剂量组之间之对数剂量差值；

xk：最大剂量的对数值；

q：存活率（q=1-p）；

∑p：各剂量组死亡率总和；

n：每组动物数。

例如：小鼠经口给予某化学物质的剂量和死亡数资料见表2-4。

按式计算得：lgLD50=1.4961-0.08（2.3-0.5）=1.3521

lgLD50及其95%可信限为1.3521±1.96×0.0213=1.3521±0.0417

所以lgLD50及95%可信区间范围为22.50mg/kg（20.44～24.76mg/kg）。

Ⅱ 经呼吸道静式吸入急性毒性实验

一、目的

经呼吸道急性毒性实验是卫生毒理学的重要基本实验技术之一。外源性化学物经呼吸道吸人是工业毒理学和环境毒理学中最常见的接触途径之一，也是药品和农药的接触途径之一。常用于研究气态、蒸气态、气溶胶、烟尘、粉尘状的外源性化学物对呼吸道损伤、吸收后对机体损害。可求出吸入接触的半数致死浓度（LC50），并进行急性毒性分级。本实习的目的是学习静式呼吸道染毒技术，掌握LC50的实验步骤和方法。

二、原理

呼吸道吸入染毒可分为两种方式，一是动式吸入，一是静式吸入。其类型又可分为两种，一是将实验动物整体置于染毒柜中；一是只将实验动物的口鼻部位与染毒柜中含受试物的空气接触，身体其他部位置于染毒柜外，也称为面罩吸入染毒。

1．静式吸入染毒

系将实验动物置于一个一定的体积密闭容器内，加入定量的易挥发液态受试化合物或一定体积的气态受试化合物，在容器内形成所需的受试化合物的空气环境。接触一定时间（一般为2h或4h）后，观察动物的中毒反应，并根据动物的死亡情况和相应的受试物浓度，求出LC50。

这种接触方式，染毒柜的体积与所放置的动物数量应相适应，否则会出现缺氧与二氧化碳潴留现象。一般要求在接触期内染毒柜的氧分压不能低于19%，二氧化碳分压不能超过1.7%。染毒柜体积、放置动物种类和数量及放置时间相互关系见表2-5。

2．染毒柜

有机玻璃制成，现有容积有60L和100L两种规格。

柜顶盖部有三个附件。一个是投药孔，一个是用于混匀蒸气或气体的小电扇，一个是插入温度计的孔。在柜壁上挂有一个小不锈钢碟为接受和蒸发液态受试物的药物蒸发器（图2-1）。

三、内容

（1）静式呼吸道吸入染毒操作。

（2）毒性体征的观察和LC50计算。

四、试剂和材料

（一）实验动物

健康成年昆明小鼠60只，体重22g～24g，雌雄各半。

（二）器材

静式吸入染毒柜有（60L和100L）两种规格、动物称（电子天平，感应量0.1/1000g）、刻度吸管(0.2、0.5、1.0、5.0m1)、洗耳球、动物笼、编号笔。

（三）试剂

（1）受试物：苯（分析纯）、d=0.878g/ml。

（2）苦味酸酒精饱和液。

五、操作步骤

（1）小鼠称重、编号与分组（见第一章第二节）。

（2）剂量设计设6个剂量组，具体方案如下（见表2-6）：

静式染毒多采用计算方法折算染毒柜内受试化合物的浓度，易挥发液体化合物浓度计算式为：

式中：C——实验设计受试化合物的浓度（mg/L）；

a——应加入受试化合物的量（ml）；

d——受试化合物的比重（g/ml）；

L——染毒柜体积（L）。

（3）呼吸道吸人染毒将已称重、编号的小鼠放入染毒柜内，加盖时注意蓝色小盖帽（为加药孔）对准挂在柜臂的小不锈钢碟（接物蒸发器）并扣紧，根据设计的剂量浓度及染毒柜体积，计算出应加入苯溶液的量，用刻度吸管吸取苯溶液并经加药孔加到不锈钢碟上，接通电源小电扇开启，计时。观察、记录中毒体征和动物死亡情况，按表填写（参照本章表2-2）。染毒时间2小时。

（4）LC50计算参照本章第一节（经急性毒性试验）。LD50计算方法进行计算。

六、结果评定

依据小鼠中毒体征、死亡时间、LC50，参考相应的急性毒性分级标准（表2-7），判断该受试物的毒性大小及其毒性特征。

七、实验报告

见经口急性毒性实验实习要求。

八、注意事项

（1）注意染毒柜密闭，保持柜内受试物浓度，防止污染周围环境和影响操作者。

（2）染毒结束，应在启动的通风柜内开启染毒柜，待20分钟后取出小鼠，活的脱臼处死。

（3）中毒死亡及脱臼处死的小鼠，装进塑料袋（注意不要夹带任何杂物放进塑料袋），集中送到动物饲养准备室，置于冰柜专用纺织袋冷冻贮存待销毁。

Ⅲ 经皮肤急性毒性实验

一、目的和意义

某些外源化学物与皮肤接触，可经皮肤吸收后引起机体中毒，或引起皮肤、黏膜局部损伤。经皮接触毒性实验是指在实验动物体表脱毛部位的完好皮肤一次或24小时内多次涂布不同剂量受试样品后，观察所产生的健康损害效应。

确定受试样品能否经皮肤吸收和短期经皮染毒所产生的毒性作用和强度，求出该受试样品经皮肤染毒的LD50，为确定亚急（慢）性经皮毒性及其他实验的剂量设计提供实验依据，估计人体接触后可能出现的类似危害。

二、原理

选择健康动物，先去除实验动物受试部位的被毛。将实验动物分成若干剂量组，每组涂布不同剂量的受试样品，而后观察实验动物中毒反应和死亡情况，计算LD50。对实验中死亡的动物做大体解剖和病理学检查，对实验结束时的存活动物也应做大体解剖。注意排除受试样品引起的皮肤局部刺激或腐蚀作用所致的全身效应。

三、内容

（1）掌握动物脱毛技术。

（2）熟悉动物经皮染毒操作。

（3）动物中毒症状的观察和LD50的计算。

（4）外源化学物对皮肤局部作用的观察和评价方法。

四、材料与试剂

1．实验动物

首选成年、健康大鼠，也可选用豚鼠或家兔。实验动物体重要求范围分别为：大鼠200g～300g，豚鼠350g～450g，家兔2000g～3000g。

2．试剂

（1）固体受试样品应研磨，过100目筛。用适量无毒无刺激性赋形剂混匀，以保证受试样品与皮肤良好的接触。液体受试样品一般不必稀释，可直接用原液实验。

（2）脱毛剂1份硫化钡和4份滑石粉（质量比），使用前临时用温水调成糊状。也可用1份硫化钠和4份淀粉同法调配。

3．器材

解剖剪刀、细玻璃棒、棉球、医用纱布、油纸、无刺激性胶布或网孔尼龙绷带，动物秤。

五、实验步骤

1．剂量和分组

实验动物随机分为4～5个剂量组。若使用水、植物油、凡士林、羊毛脂外的赋形剂，则需设赋形剂对照组。豚鼠或大鼠每一剂量组（单性别）不少于5只；家兔每一剂量组（单性别）不少于4只。实验期间，为避免实验动物相互抓挠，应采用单笼喂养。

各剂量组间要有适当的组距，可按等比或等差级设置剂量，以使各剂量组实验动物产生的毒性反应和死亡率呈现剂量-反应（效应）关系。

一般情况下，如果剂量达到2000mg/kg·bw仍不出现实验动物死亡时，则不需要再进行高剂量实验。

2．动物脱毛

实验前24h，在动物背部正中线两侧剪毛或剃毛，仔细检查皮肤，要求完整无损，以免改变皮肤的通透性。去毛面积不应少于实验动物体表面积的10%。一般家兔约为150cm2，大鼠、豚鼠约为40cm2，体表面积（S）与体重（W）有关，其计算公式如下：

S=10.4W0.667

剂量单位可用每千克体重接触受试外源化学物的毫克数表示（mg/kg），也可用每平方厘米体表面积接触受试物的毫克数表示（mg/cm2）。

剪去脱毛区的被毛后，均匀涂抹一薄层脱毛剂，3～5分钟后用细玻璃棒轻拨去毛，并用棉球沾温水轻轻擦洗，洗净脱毛剂。

3．染毒

脱毛24小时后，将动物固定，定量均匀涂布1ml受试物（不同剂量组需配不同浓度的受试物）于实验动物的脱毛区，依次用油纸、医用纱布、无刺激性胶布或网状尼龙绷带加以固定，保证受试物与皮肤的密切接触，防止脱落和动物舔食受试样品。涂布4小时后取下固定物和覆盖物，用温水或适当的溶剂洗去皮肤上残留的受试样品。

4．观察期限及指标

观察并记录染毒过程和观察期内的动物的中毒表现和死亡情况。观察期限一般为14天，全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官，观察指标见本章急性经口毒性实验Ⅰ（表2-2）。对死亡动物进行尸检。观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖，如有必要，进行病理组织学检查。

六、实验结果评价

依据实验动物中毒症状、死亡时间、LD50，参照相关的急性毒性分级标准进行评定，判断该受试物的毒性大小及毒性特征。

七、注意事项

1．鉴定报告内容

（1）实验动物种属品系、来源、饲养环境、饲料和饮水。

（2）按剂量组列表说明每组动物数、性别状况、出现毒效应的动物数、死亡动物数。

（3）染毒时间、染毒持续时间、染毒后动物中毒的主要表现。

（4）LD50计算方法。

（5）LD50值及其95%可信区间（包括雌、雄实验动物各自的LD50）。

（6）病理组织学检查结果。

（7）结论。

2．脱毛时应避免误伤动物皮肤。

3．实验过程中应防止受试物对实验人员外露皮肤和眼睛的污染。

八、实验结果分析

经皮LD50是评价化学物急性毒性的重要参数之一，也是急性毒性分级的依据。但LD50仅表示受试样品经皮吸收引起实验动物死亡50%的剂量，并不能全面反映受试样品经皮吸收的所有急性毒性特征，因此，评价一受试样品经皮急性毒性既要考虑其对某一品系实验动物的经皮LD50值，又要考虑其中毒症状表现及反应出现的早晚和持续时间的长短，并结合体重变化与病理学检查结果等，经综合分析才能得出经皮急性毒性较为全面的评价。